Exemples d’applications en oncologie

DRACCAR Quantification de l’ADN et analyse de la ploïdie

Quantification de l’ADN et application en ploïdie pour la recherche contre le cancer

ADCIS et le Centre François Baclesse à Caen ont développé en partenariat un système complet pour quantifier l’ADN et analyser la ploïdie. il faut savoir que cette application est effectuée en routine dans des laboratoires impliqués dans la cyto-pathologie et l’oncologie. Partant d’algorithmes développés dans les années 90 sur un système sous UNIX, 1, ADCIS a porté tous les algorithmes de traitement d’images dans l’environnement d’Aphelion™ sur un PC sous Microsoft Windows®. Le portage de l’application sur un PC a grandement amélioré la performance et la facilité d’utilisation du logiciel basé sur les composants ActiveX d’Aphelion. L’utilisation d’Aphelion a également permis de réduire de manière importante le coût global du système.

Le système inclut un microscope optique équipé d’une platine automatisée pouvant se déplacer selon les directions X, Y et Z ; une caméra noir et blanc montée sur le microscope et un PC dans l’environnement Microsoft Windows® avec une carte d’acquisition et numérisation.

Les techniques de traitement d’images impliquées dans l’application sont plutôt complexes et peuvent être décomposées selon les étapes suivantes :

  • Acquisition d’une série d’images à partir d’un échantillon placé sur la platine motorisée. Le déplacement de la platine est totalement géré par le logiciel, où chaque étape de l’initialisation de la platine est définie depuis une interface utilisateur extrêmement conviviale basée sur des assistants multiples qui aident à configurer le système.
  • Les images issues de la caméra sont calibrées en utilisant des techniques basées sur l’analyse de la densité optique afin de s’assurer que la densitomètrie à l’intérieur des cellules est quasiment constante.
  • Ensuite, une segmentation est réalisée afin de générer une série d’imagettes contenant chacune une cellule, et une grille est remplie avec les attributs associés à chaque cellule.
  • Un ensemble de 19 paramètres basés sur la forme, l’intensité et la texture est calculé et sauvegardé dans la grille. Chaque ligne de la grille contient les données relatives à une cellule et l’ensemble correspond à un Objectset d’Aphelion.
  • Une classification manuelle est réalisée une fois pour toute pour chaque cancer analysé. Au cours de cette phase de classification, chaque cellule est placée dans une catégorie en fonction de la morphologie du noyau : cellules normales épitheliales, lymphocytes, cellules stromales et anormales, cellules de taille et texture non standard, etc.
  • Un modèle est dérivé de la base d’apprentissage, en utilisant des techniques basées sur l’analyse par composantes principales.
  • Lors de l’utilisation de l’application en routine, la classification automatique est réalisée en utilisant les mêmes méthodes statistiques et en partant du modèle issu de la phase d’apprentissage.
  • Après analyse de l’échantillon dans sa globalité, les différents histogrammes de ploïdie sont calculés pour les cellules normales et anormales et visualisés dans l’interface utilisateur.

Durant la phase de développement du logiciel, tous les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus avec un cytomètre en flux. La souplesse d’utilisation du système basé sur l’analyse d’images a permis de montrer l’intérêt d’un tel système capable d’identifier et éliminer les débris et les cellules stromales non désirables. Il faut noter que les échantillons de formaline fixée et de paraffine ont pu être analysés avec le système développé dans le cadre de cette étude.

Les captures d’écran ci-dessous illustrent deux des fenêtres du logiciel.

Cell segmentation
Cell classification Cell classification
DNA Histogram 2D Cloud

Le développement spécifique réalisé par les ingénieurs de la société ADCIS a inclus la définition de l’interface utilisateur, l’implémentation des algorithmes de segmentation d’images, le contrôle complet de la platine motorisée et enfin le développement du module de classification qui est maintenant disponible sous forme d’un composant ActiveX autonome. L’application a été développée en langage Visual Basic et fait appel aux composants ActiveX et les Toolkits d’Aphelion.

Les développements futurs effectués sur le produit vont porter sur des analyses statistiques plus poussées comme l’analyse de la dispersion et les nuées dynamiques.

Cette application met en valeur la puissance des composants ActiveX du logiciel Aphelion utilisés dans le cadre de cette analyse automatique de la ploïdie. Le système a ainsi pu être développé rapidement et il est maintenant suffisamment ouvert pour être facilement maintenu et enrichi de nouvelles fonctionnalités.

ADCIS et le GRECAN (bioticla) du Centre anti-cancéreux François Baclesse sont actuellement en train de développer une application en biologie basée sur l’analyse des immuno-marqueurs et des outils spécifiques pour la pathologie clinique et expérimentale.

1 Bloyet et al., Cytometry, 1999, 37 (4), 267-274

ImagePath Quantification de l’ADN et analyse de la ploïdie

Chargement de l’image ploidy.gif

Système ImagePath DNA Ploidy

Les systèmes de la société ImagePath fournissent des solutions d’imagerie clef en mains pour les laboratoires.

La société ImagePath offre des produits de type reagent, des microscopes, des caméras avec ordinateurs et des systèmes d’imagerie propriétaires, dans le domaine de l’analyse de la ploïdie (mesure de l’ADN de noyaux cellulaires individualisés et marqués au Feulgen). Les systèmes ImagePath sont capables d’analyser automatiquement des milliers de noyaux à la minute, une vitesse que l’on ne pouvait difficilement imaginer il y a quelques années.

Les systèmes de la société sont optimisés pour l’acquisition d’images couleur à des résolutions de 1315 x 1024 pixels - ce qui permet de voir des détails proches de la résolution optique du microscope. Les images acquises peuvent être annotées et sauvegardées sur disque, ainsi qu’exportées vers d’autres logiciels graphiques.

Le système ImagePath 300 comprend un logiciel spécialisé et performant d’analyse rapide de la ploïdie en suivant des instructions simples et intuitives depuis des menus déroulants et des procédures qui améliorent la précision et la reproductibilité des mesures obtenues. L’utilisateur peut interagir dans les images et les résultats de mesure grâce à des passages de message entre les différentes fenêtres de visualisation. Ainsi, des actions entreprises avec la souris dans une image entraînent le surlignement des données correspondantes dans les courbes de mesure ou dans les tableaux visualisés dans d’autres fenêtres.

RAMIS sélection de molécules innovantes inhibant la division cellulaire

Logiciel pour la sélection de molécules innovantes inhibant la division cellulaire

But du projet

Imagerie multi-paramétrique à haute résolution pour la caractérisation et la sélection de molécules et/ou de cibles protéiques innovantes agissant sur la division cellulaire.

Contexte

Au cours de ces dernières années, des stratégies de criblage de molécules basées sur la recherche d’un effet pharmacologique au niveau cellulaire, plutôt que moléculaire, ont pris un nouvel essor grâce au concept de criblage phénotypique à haut contenu (HCS).

Ce type de criblage permet de sélectionner directement des molécules capables de pénétrer les cellules et d’induire un changement phénotypique cellulaire d’intérêt. Il s’appuie sur l’utilisation combinée :

  • Du marquage de protéines spécifiques présentes dans les cellules (GFP ou anticorps fluorescents) ;

  • De l’imagerie microscopique automatisée ;

  • De l’analyse d’images.

L’analyse de changements phénotypiques complexes, combinant plusieurs marqueurs, plusieurs paramètres calculés à partir de ces différents marqueurs et plusieurs conditions de traitement, offre la possibilité de générer un phénotype et/ou des profils phénotypiques caractéristiques de l’effet pharmacologique d’une molécule donnée. La comparaison de profils phénotypiques peut alors permettre de sélectionner des molécules au mécanisme d’action original et/ou agissant sur des cibles innovantes. Pour être performants, les criblages phénotypiques nécessitent la mise en place de solutions technologiques adaptées à la détection, la quantification et l’analyse des changements observés.

Objectifs

L’objectif du projet RAMIS est de développer une stratégie innovante de criblage basée sur l’imagerie haute résolution pour la caractérisation phénotypique de nouvelles molécules et de nouvelles cibles interférant avec la division cellulaire de cellules cancéreuses humaines, en particulier avec la mitose.


Le projet comprend deux axes bien distincts mais complémentaires :

  • La constitution d’une base de données d’images à haut contenu d’information représentative de phénotypes induits par des traitements de référence (molécules, ARN interférent). Les images sont acquises avec une plate-forme de microscopie à fluorescence automatisée, à partir de cellules multi-marquées (ADN, microtubules, centrosomes, autre protéine). Dans un premier temps, ces images sont annotées manuellement par des experts afin de catégoriser chaque cellule et de formaliser la connaissance par apprentissage ;

  • Le développement d’un logiciel, appelé RAMIS (Rock, Module d’Analyse et Interface pour le Screening), capable d’analyser ces images au niveau des cellules individuelles et de la population de cellules, et capable de générer et comparer des profils phénotypiques caractéristiques des traitements appliqués. Ce logiciel basé sur le dialogue homme-machine est organisé autour :

    (a) d’un moteur de consensus formalisant les connaissances de biologistes experts,

    (b) de bases de phénotypes / profils phénotypiques,

    (c) d’un moteur de recherche et de comparaison pour permettre l’identification et la caractérisation de traitements originaux.

RAMIS : Constitution de la base d’images

Constitution de la base d’images

RAMIS : Identification automatique de nouveaux phénotypes

Identification automatique de nouveaux phénotypes

RAMIS : Pile d’images

Pile d’images

RAMIS : Résultat de la projection de la pile d’images

Résultat de la projection de la pile d’images
(Projection Toolkit)

Le logiciel RAMIS donnera un avantage compétitif à ses utilisateurs en permettant l’identification de molécules et/ou cibles originales. Son utilisation sera très intuitive et la base de données images pourra être enrichie par les utilisateurs. Le logiciel développé au cours du projet sera commercialisé par la société ADCIS.

Les partenaires du projet et leurs rôles

L’Institut de Recherche Pierre Fabre (IRPF), en charge de toutes les activités de recherche et développement des Laboratoires Pierre Fabre, qui apporte son expertise dans la découverte d’agents anticancéreux et dans les domaines de l’onco-pharmacologie, ainsi que ses compétences en matière d’acquisition d’images, de microscopie et de développement logiciel.

Le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), établissement de recherche public, qui apporte ses connaissances dans le domaine de la biologie cellulaire fondamentale et, en particulier, un haut degré d’expertise de la division cellulaire et des phénotypes associés.

ARMINES, association de recherche de Mines ParisTech, qui apporte son savoir-faire en analyse d’images pour développer des méthodes de description quantitative des cellules, son expérience en statistique, apprentissage et modélisation de systèmes biologiques pour la classification de phénotypes.

La société ADCIS qui apporte ses compétences dans le développement de logiciels innovants et performants basés sur des techniques d’imagerie. La contribution d’ADCIS comprend le développement de l’environnement du logiciel RAMIS et de l’interface utilisateur, la conception de la base de données images, la réalisation de l’interface d’annotation qui permettra de formaliser la connaissance de biologistes experts et l’intégration des différents algorithmes de traitement d’images et de classification développés par les partenaires scientifiques.

Financement

Le projet RAMIS a été labellisé le 20 avril 2007 par le Pôle de Compétitivité Cancer-Bio-Santé de la Région Midi-Pyrénées et financé sous forme de convention FCE par la Direction Générale des Entreprises.
Les travaux ont débuté le 1er octobre 2007.

Pôle Cancer-Bio-Santé
Coordonnées des partenaires du projet
Institut de Recherche Pierre Fabre

UMR2587 CNRS-Pierre Fabre, CRP
3 Rue des Satellites
31400 Toulouse
France

+33 (0)5 34 32 14 00

+33 (0)5 34 32 13 50

www.cnrs.fr/midi-pyrenees

ARMINES

Centre de Morphologie Mathématique et Centre de BioInformatique
60 Boulevard Saint Michel
75272 Paris Cedex 06 - France

+33 (0)1 64 69 47 06

+33 (0)1 64 69 47 05

www.armines.net

CNRS

UMR2587 CNRS-Pierre Fabre
3 Rue des Satellites
31400 Toulouse
France

+33 (0)5 34 32 14 00

+33 (0)5 34 32 13 50

www.cnrs.fr/midi-pyrenees

ADCIS

3 rue Martin Luther King
14280 Saint-Contest
France

+33 (0)2 31 06 23 00

+33 (0)2 31 06 23 09

www.adcis.net

Stereology Analyzer: Stereological analysis of 3D structures using 2D section or projection images

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Stereology Analyzer is a simple to use software tool for reliably estimating quantifications of important 3D structures. This tool is general in its implementation, but has applicability to various scientific domains, most commonly in medicine, materials science, and geology.

The common factors in these fields are the need to characterize and quantify microscopic structures of interest ("SOI") and the use of very large images (i.e., virtual slides or composite images).

Where automated processes don't exist or fail to compute SOI parameters reliably, stereology is the method of choice to estimate these parameters. In fact, stereology is also frequently used to validate the proper performance of complex, automated algorithms. Stereology Analyzer is a faithful implementation of long-accepted stereological and statistical methods in the context of today's software technology.

Science Structures Of Interest
Medicine Tumor, vessels, cell, hotspot, etc.
Materials Grain, inclusion, boundary, pore, etc.
Geology Pore, phase, etc.

Stereology Background

Stereology Analyzer 3D and 2D

Image courtesy of Paulette Herlin

The term stereology was first introduced in 1961 when the International Society for Stereology (ISS) was founded by a small group of scientists, although the basis of stereology theory was defined more than 300 years ago. By definition, stereology is the science that studies the geometric relationship between a structure that exists in 3D space and a set of images of the same structure that are fundamentally defined in 2D space (images of slices, sections, or projections). Note that standard 2D image processing techniques will hardly provide 3D information from sections, except for the volume fraction value.

Stereology Analyzer

Stereology Analyzer Presentation

Stereology Analyzer implements long-standing and accepted stereology techniques that employ an interactive grid overlaid on regions of interest ("ROI") in a 2D image. Stereology Analyzer enables the user to optionally define one or more ROIs and a grid that overlays the ROIs or the whole image. The type and spacing of the grid can be adjusted by the user to achieve the best estimates of the SOI parameters contained within the ROIs. The types of grids are characterized by the geometric element that displays at the grid's nodes. Grid element alternatives include points, lines, frames, squares, and circles.

After the grid and ROIs are defined, the user manually highlights SOIs that are intersected by the grid elements. The number of grid elements contained within the ROIs and the number of highlighted SOIs are then automatically counted and used to compute SOI parameters. The automatic computations are based on classical stereological and statistical analyses. These computational results are then displayed on the computer's screen and can be exported into third party environments (e.g., Excel, Word) for display and further analysis specific to the applicable field.

Image Processing Algorithm Validation

Experts in the applicable field can use Stereology Analyzer to quickly compute unbiased estimates of SOI parameters on virtual slides. If used properly, Stereology Analyzer is an effective alternative for image processing developers to validate a sequence of complex image processing algorithms. In addition, while complex algorithms require careful validation of their results, stereology results require no validation since results are derived from a standard statistical analysis of grid elements and user-highlighted SOIs.

In the field of medicine, when the SOIs cannot be highlighted by a specific staining (e.g., histochemical or immunohistochemical stainings), or when staining is not optimal or tissue is heterogeneous, then the techniques of stereology are the best alternative for estimating the parameter values of SOIs.

When specific staining is effective, different image processing and analysis algorithms can be developed that vary in their complexity, accuracy, and efficiency. Stereology Analyzer is a powerful tool for establishing the quantification accuracy that an algorithm sequence should achieve to be relied on. The statistical sampling process used in stereology science diminishes the difficult problem resulting from tissue heterogeneity. The special strength of stereology is that it always provides unbiased estimates of SOI parameters for any complexity of sample tissue. When combining stereology and image processing in pathology and scanning microscopy fields, the user has a broad set of powerful tools to characterize SOIs on virtual slides.

Capabilities

The Stereology Analyzer has the following capabilities:

  • Grid: Uniform and user definable in density and type. Types include points, frames, squares, circles, and lines
  • Region of interest: User definable, multiple regions allowed, can be any shape (e.g., ellipse, rectangle, and free-hand drawing)
  • Undesired tissue: User can exclude undesired tissue and other undesired area regions
  • Input: Input image formats are TIFF, tiled TIFF, and JPEG
  • Output: Volume fraction, numeric density of SOI profiles per unit area
  • Keyboard shortcuts: Provided to speed up the SOI marking process

Related Publications

  • [1] G. Matheron, 1975. Random set and integral geometry. J. Wiley and sons, New York, USA.
  • [2] E.R. Weibel, 1981. Stereological methods in cell biology: where are we--where are we going? J. Histochem. Cytochem., 29, 1043-1052
  • [3] H. J. G. Gundersen, R. Østerby, 1981. Optimizing sampling efficiency of stereological studies in biology: or “Do more less well!” J. Microsc., 121, 65-73.
  • [4] V. Howard and M. Reed, 1998. Unbiased Stereology. Three-dimensional measurement in microscopy. Microscopy handbooks 41, Bios Scientific Publishers, UK.
  • [5] J. Russ, R. Dehoff, 1999. Practical Stereology, 2nd Edition, Plenum Press, New York.
  • [6] L. Kubınova, X. W. Mao, J. Janacek, J. O. Archambeau, 2003. Stereology Techniques in Radiation Biology, Radiation Research 160, 110-119.

Acknowledgements

The concept of this module is derived from the Stereology expertise of Paulette Herlin and her original development works at the Centre François Baclesse Cancer Center. The expertise of Dr Dragos Vasilescu, PhD, in the field of stereology and the use of combined grids, University of British Columbia, Vancouver, V6Z 1Y6, Canada, helped ADCIS to develop the latest version of the Stereology Analyzer Software product.

Main benefits of Image Quality Extension:

  • Perform measurements when image processing is not possible or too complex
  • Best method to validate image processing algorithms on very large images
  • Provide unbiased measurements and an accurate volume estimate
  • Estimate 3D characteristics of structures from a 2D slice or projections
  • Compatible with most virtual slide acquisition devices

Video tutorial